KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO HEP-G2 CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta L.)

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO HEP-G2 CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta L.)

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO HEP-G2 CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta L.)

Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước

Khoa Khoa học Tự nhiên, TrườngĐại học Cần Thơ

TÓM TẮT NGHIÊN CỨU CÂY AN XOA

Từ cao chiết của cây An Xoa (Helicteres hirsuta L.) thu tại Hòn Sơn thuộc xã Lại Sơn, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang, nghiên cứuđã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) đối với bốn phân đoạn cao khác nhau: petroleum ether (PE), dichloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH). Kết quả có hai cao có biểu hiện hoạt tính gâyđộc với dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) là cao PE và cao DC. Từ cao DC đã cô lập được 4 hợp chất: stigmasterol, lupeol, apigenin và tiliroside. Cấu trúc hóa học các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) kết hợp với so sánh tài liệu tham khảođã công bố.

  1. ĐẶT VẤN ĐỀ VỀ CÂY AN XOA

Cây An Xoa có tên khoa học là Helicteres hirsuta L.. Theo kinh nghiệm dân gian rễ và lá được sử dụng làm thuốc. Rễ chữa lỵ, sởi, cảm mạo, đái dắt và làm thuốc tiêu độc. Lá dùng ngoài chữa mụn nhọt, sưng lở (Võ Văn Chi, 2004). Theo một nghiên cứu ở Indonesia (Chin YW etal., 2006) thì cây An Xoa có khả năng chống lại các tế bào ung thư, nhất là ung thư gan. Ở Việt Nam, cây An Xoa còn gọi là tổ kén cái hay dó lông, cũng được sử dụng nhiều trong việc-NMR, 13C-NMR, DEPT) kết hợp với so sánh tài liệ tham khảo đã công bố. chữa trị các chứng bệnh về gan. Tuy nhiên, việc sử dụng cây An Xoa chỉ dựa vào kinh nghiệm dân gian và có ít tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học có trong loài cây này. Do đó, nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây An Xoa nhằm góp phần giải thích công dụng chữa bệnh của loài thảo dược này.

  1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CÂY AN XOA

2.1 Nguyên liệu, hóa chất

Mẫu thực vật được dùng là thân, lá và hoa câyAn Xoa (Helicteres hirsuta L.) được định danh bởi TS. Đặng Minh Quân, Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ. Mẫu thực vật được rửa sạch, phơi khô và xay nhỏ làm nguyên liệu dùng trong nghiên cứu. Dung môi: ethanol 96% (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EA), dichloromethane (DC), petroleum ether (PE) (Chemsol Việt Nam). Silica gel dùng cho sắc ký cột là silica gel loại 230-400 mesh (Ấn Độ), sắc ký lớp mỏng (TLC) tráng sẵn silica gel 60 F254 Merck (Đức), thuốc thử hiện hình: vanilin trong dung dịch H2SO4 10% và methanol.

2.2 Phương pháp và thực nghiệm

2.2.1 Chiết xuất

Bột khô của cây An Xoa được ngâm dầm trong ethanol trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lọc và cô quay thu hồi ethanol thu được cao ethanol. Cao ethanol được chiết lần lượt với các dung môi PE, DC, EA, MeOH được bốn cao phân đoạn tương ứng là cao PE , cao DC, cao EA và cao MeOH.

2.2.2 Thử hoạt tính gâyđộc tế bào

Các cao chiết được gửi thử tại Phòng Sinh học Thực nghiệm – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) được thực hiện theo phương pháp của Skehan (1990) và Likhiwitayawuid (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.

2.2.3 Phân lập các hợp chất và xácđịnh cấu trúc

Nghiên cứu thành phần hóa học tập trung vào cao DC do có biểu hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2. Cao DC được tách bằng sắc ký cột pha thường nhiều lần với các hệ dung môi tỷ lệ thay đổi theo hướng tăng dần độ phân cực, kết hợp phương pháp kết tinh lại và kiểm tra độ sạch bằng sắc ký bản mỏng, cuối cùng thu được các hợp chất tinh khiết. Từ 8 g cao dichloromethane tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần được 16 phân đoạn kí hiệu từ DC1-15. Chọn những phân đoạn có vết tròn tách rõ tiếp tục sắc kí cột. Phân đoạn DC2 (68 mg), được sắc ký cột với hệ dung môi PE:EA tăng dần độ phân cực. Kết quả ở phân đoạn PE:EA 15:1 thu được 11 mg chất sạch kết tinh hình kim màu trắng, kiểm tra lại bằng TLC giải ly bằng hệ dung môi PE:EA 9:1, kết quả được một vết tròn màu tím khi hiện vết bằng thuốc thử vanilin trong MeOH và H2SO4 10% (Rf = 0,26). Hợp chất này được ký hiệu là HD09. Phân đoạn DC3 (128 mg), được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi PE:EA tăng dần độ phân cực. Kết quả ở phân đoạn PE:EA 7:1 thu được 7 mg chất sạch kết tinh hình kim màu trắng đục, kiểm tra lại bằng TLC hệ giải ly PE:EA 2:1 kết quả được một vết tròn màu tím khi hiện hình bằng thuốc thử vanilin trong MeOH và H2SO4 10% (Rf = 0,47). Hợp chất này được ký hiệu là HD02. Phân đoạn DC5 (50 mg), được tiếp tục sắc ký cột với hệ dung môi PE:EA tăng dần độ phân cực. Kết quả ở phân đoạn PE:EA 4:1 thu được 3 mg chất sạch kết tinh dạng bột màu vàng, kiểm tra lại bằng TLC hệ giải ly PE:EA 1:1, kết quả được một vết tròn màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử vanilin trong MeOH và H2SO4 10% (Rf = 0,38). Hợp chất này được ký hiệu là HD08. Phân đoạn DC8 (86 mg), được tiếp tục sắc ký cột với hệ dung môi PE:EA tăng dần độ phân cực. Kết quả ở phân đoạn PE:EA 2:1 thu được 7 mg chất sạch kết tinh dạng bột màu vàng, kiểm tra lại bằng TLC hệ giải ly EA:Me 3:1, kết quả được một vết tròn màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử vanilin trong MeOH và H2SO4 10% (Rf = 0,67). Hợp chất này được ký hiệu là HD01. Các hợp chất này được xác định cấu trúc và nhận danh nhờ so sánh dữ liệu phổ: 1H-NMR, 13CNMR với các tài liệu tham khảo

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư trong cây an xoa

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào được trình bày trong Bảng 1 (CS% là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của cao thử tính theo % so với đối chứng). Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào ung thư gan: Ellipticine pha trong DMSO. Từ kết quả trên cho thấy có hai cao chiết biểu hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2 là cao PE và cao DC với giá trị CS% đều bé hơn 50%. Hai mẫu có biểu hiện hoạt tính được chọn tiếp tục thử nghiệm để tìm giá trị IC50. Giá trị IC50 của cao PE là 28,29 g/mL và cao DC là 30,30 g/mL. Kết quả này phù hợp với khả năng trị bệnh gan của cây An Xoa trong dân gian.

3.2. Xác định cấu trúc và nhận danh các hợp chất có trong cây an xoa

3.2.1 Hợp chất HD09

Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δH ppm, JHz): 0,68, 0,79, 0,82, 0,86, 0,93, 1,02 (3H, s, Me ×6), 3,52 (1H, m, H-3), 5,34 (1H, d, J = 5 Hz, H-6),5,15 và 5,02 ppm. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125MHz, δC ppm): 140,8 (C-5), 138,5 (C-22), 129,5(C-23), 121,7 (C-6), 71,8 (C-3 ), 56,8 (C-14), 56,1(C-17), 50,1 (C-9), 45,9 (C-20), 42,3 (C-13), 39,8(C-12), 42,3 (C-4), 37,3 (C-18), 36,5 (C-1), 36,1(C-10), 33,9 (C-8), 31,9 (C-7), 29,2 (C-16), 31,9(C-2), 28,2 (C-25), 26,1 (C-21), 24,3 (C-15), 21,1(C-11), 19,8 (C-27), 19,3 (C-26), 23,1 (C-19), 12,0(C-29), 19,0 (C-28), 11,9 (C-24). Phổ 1H-NMR xuất hiện 6 tín hiệu proton methyl ở vùng trường cao, 3 tín hiệu proton methine mang nối đôi ở H 5,34 (1H, d, 5,0 Hz); 5,15 và 5,02 ppm. Ngoài ra còn có tín hiệu của 1 proton methine kề oxygen ở H 3,52 ppm (1H, m).

Các tín hiệu này phù hợp với đặc trưng của hợp chất steroid.

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện của 29 tín hiệu carbon, gồm có 3 carbon bậc bốn, 11 carbon methine, 9 carbon methylene và 6 carbon methyl đặc trưng của hợp chất sterol. Đặc biệt, tín hiệu của hai cặp olefin được xác nhận tại δC 140,8; 121,7; 138,5 và 129,5 ppm. Từ những dữ kiện trên kết hợp so sánh với bài báo đã công bố của Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash (2012) cho phép xác định hợp chất HD09 là stigmasterol Stigmasterol được sử dụng trong phòng ngừa khối u và kháng oxy hóa. Ngoài ra, stigmasterol còn có tiềm năng chữa viêm xương khớp (Tirtha Ghosh et al., 2011).

3.2.2 Hợp chất HD02

Phổ 1H-NMR (CDCl3&MeOD, 500 MHz, δHppm, J Hz): 4,72 (1H, d, J = 1,5Hz, H-29a), 4,59(1H, s, H-29b), 3,16 (1H, dd, J = 9,5, J = 7,0 Hz,H-3), 3,00 (1H, m, H-19), 0,75, 0,82, 0,94, 0,95,0,97, 0,97, 1,69 (3H, s, Me × 7), 0,68 (1H, d, J =10,0, H-5). Phổ 13C-NMR (CDCl3&MeOD, 125MHz, δC ppm): 37,3 (C-1), 27,6 (C-2), 79,0 (C-3),38,9 (C-4), 55,5 (C-5 ), 18,4 (C-6), 32,4 (C-7), 40,8(C-8), 50,7 (C-9), 37,3 (C-10), 21,0 (C-11), 25,7(C-12), 38,4 (C-13), 42,5 (C-14), 29,8 (C-15), 34,5(C-16), 56,4 (C-17), 49,5 (C-18), 47,1 (C-19),150,9 (C-20), 30,7 (C-21), 38,8 (C-22), 28,0(C-23), 15,4 (C-24), 16,1 (C-25), 15,9 (C-26), 14,7(C-27), 18,4 (C-28), 109,5 (C-29), 19,3 (C-30). Phổ hồng ngoại (IR), (KBr, νmax cm-1) tín hiệu ở 3432,04 cm-1 là dao động đặc trưng của liên kết O-H, tín hiệu 1642,64 cm-1 là dao động của C=C, tín hiệu ở 1378,35 cm-1 là dao động của CH3, tín hiệu 1235,85 cm-1 là dao động liên kết C-O. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3&MeOD, δH ppm) xuất hiện 7 tín hiệu proton methyl ở vùng từ trường cao, 2 proton methylene mang nối đôi ở H 4,72 và 4,59 ppm. Ngoài ra còn có tín hiệu proton methine kề oxy ở H 3,16 ppm. Các tín hiệu này phù hợp với đặc trưng của hợp chất pentacyclic triterpenoid. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3&MeOD, δ ppm) kết hợp với phổ DEPT của hợp chất HD02 cho tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, trong đó có 6 carbon bậc bốn, 6 carbon methine, 11 carbon methylene và 7 carbon methyl đặc trưng cho một hợp chất triterpene khung lupan. Sự có mặt của 1 liên kết đôi tại hai carbon δC 150,9 và 109,3 ppm. Tín hiệu của 1 carbon oxymethine tại δC 79,03 ppm cho phép xác định có 1 nhóm hydroxyl trong phân tử của hợp chất HD02. Từ các kết quả phân tích trên và so sánh với công bố của Md. Enamul Haque et al. (2006) cho phép kết luận hợp chất HD02 là lupeol Lupeol có thể tiêu diệt và ngăn chặn sự lan truyền của tế bào ung thư. Hợp chất lupeol có khả năng gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) (El Deel K.S. et al., 2003).

3.2.3 Hợp chất HD08

Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, δH ppm, JHz): 12,90 (1H, s, 5-OH), 7,91 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2′, H-6′), 6,90 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,74 (1H, s, H-3), 6,44 (1H, s, H-8), 6,16 (1H, s, H-6). Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, δC ppm):181,6 (C-4), 164,8 (C-7), 163,6 (C-2), 161,4 (C-4′),161,2 (C-5), 157,4 (C-9), 128,4 (C-2′, C-6′), 121,2(C-1′), 115,9 (C-3′, C-5′) 103,4 (C-10), 102,7 (C-3), 99,0 (C-6), 94,0 (C-8). Phổ hồng ngoại (IR), (KBr, νmax cm-1) tín hiệu ở 3417,86 cm-1 là dao động đặc trưng của liên kết O-H, tín hiệu ở 1655,27 cm-1 là dao động của C=O, tín hiệu 1608,64 cm-1 là dao động của C=C, tín hiệu 1240,61 cm-1 và 1174,05 là dao động liên kết C-O. Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO, δH ppm) xuất hiện 5 tín hiệu proton methine mang nối đôi gồm 3 tín hiệu mũi đơn và 2 tín hiệu của 2 cặp proton tương đương δH 7,91 ppm (2H, d, 9,0 Hz) và δH 6,92 ppm (2H, d, 8,5 Hz), chứng tỏ 4 proton này thuộc cùng một vòng thơm phù hợp với đặc điểm của flavone có vòng B đối xứng. Ngoài ra còn có 1 tín hiệu proton đặc trưng của nhóm hydroxyl kiềm nối ở vùng từ trường thấp δH 12,90 ppm. Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO, δC ppm) kết hợp với phổ DEPT cho thấy hợp chất HD08 có 15 carbon đặc trưng của khung flavone, gồm 1 carbon carbonyl δC 182,6; 5 carbon bậc 4 mang nối đôi và oxygen (δC 157,3-164,3 ppm) tương ứng với 1 carbon mang nhóm hydroxyl kiềm nối, 2 carbon mang nhóm hydroxyl ở vị trí khác vì các carbon này nằm ở vùng từ trường thấp và không xuất hiện proton của nhóm thế khác trên phổ proton và 2 carbon kề oxygen của khung flavone, 2 carbon bậc 4 vòng thơm không mang oxygen (C 103,60 và 121,1 ppm) và 7 carbon methine (C 93,9-115,9 và 128,4 ppm) tương ứng với 7 proton methine trên phổ 1H-NMR. Từ các kết quả phân tích trên và so sánh vớ công bố của Dong Gu Lee et al., 2012 cho phép kết luận hợp chất HD08 là apigenin Apigenin có khả năng chống viêm, chống oxy hóa và ngăn ngừa ung thư (Deendayal Patel et al.,2006).

3.2.4 Hợp chất HD01

Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, δH ppm, JHz): 12,50 (1H, s, 5-OH), 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 7,36 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-5”’, H-9”’),7,34 (1H, d, J=16,0 Hz, H-3”’), 6,85 (2H, d, J =9,0 Hz, H-3′, H-5′), 6,78 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-6”’,H-8”’), 6,37 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,13 (1H, d, J= 1,5 Hz, H-6), 6,10 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2”’),5,43 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1”), 4,28 (1H, d, J =10,0 Hz, H-6”a), 4,03 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 6,5 Hz,H-6”b), 3,10-3,30 (4H, m). Phổ 13C-NMR (DMSOd6, 125 MHz, δC ppm): 177,3 (C-4), 166,1 (C-1”’),164,7 (C-7), 164,7 (C-10), 161,1 (C-5), 159,9 (C-7”’), 159,7 (C-4′), 156,4 (C-9), 156,4 (C-2), 144,6(C-3”’), 133,0 (C-3), 130,8 (C-2′, C-6′), 130,1 (C-5”’, C-9”’), 124,9 (C-4”’), 120,7 (C-1′), 115,8 (C-6”’,C-8”’), 115,1 (C-3′, C-5′), 113,6 (C-2”’), 103,8 (C-10), 101,0 (C1”), 98,8 (C-6), 93,7 (C-8), 76,2 (C-3”), 74,2 (C-2”), 74,1 (C-5”), 69,9 (C-4”), 62,9 (C-6”).Phổ IR (KBr, νmax cm-1) tín hiệu ở 3461,34 cm-1 là dao động đặc trưng của liên kết O-H, tín hiệu ở1683,48 cm-1 là dao động của C=O, tín hiệu1606,12 cm-1 là dao động của C=C, tín hiệu1297,69 cm-1 và 1181,01 cm-1 là dao động liên kếtC-O.Phổ 1H-NMR (DMSO, δH ppm, 500MHz) chothấy 1 tín hiệu proton nhómhydroxyl kiềm nối ởδH 12,50 Hz và 8 tín hiệu proton methine mang nối đôi, trong đó có 4 cặp tương đương thuộc 2 vòng benzene đối xứng. Ngoài ra, ở vùng từ trường trung bình, δH ppm 3,0–5,5 là tín hiệu của các proton của phần đường, trong đó tín hiệu đặc trưng của proton anomer ở δH ppm 5,40 (1H, d, 7,0 Hz), 2 proton nhóm methylene ở δH ppm 4,28 (1H, d, 10,0 Hz) và δH ppm 4,03 (1H, dd, 6,5, 12,0 Hz). Trong 4 tín hiệu proton methine đơn lẻ có 2 tín hiệu ghép meta có thể cùng thuộc 1 vòng thơm ở δH 6,37 (1H, d, J = 2,0 Hz); 6,13 (1H, d, J = 1,5Hz) và 2 tín hiệu ghép orho ở δH 7,34 (1H, d, 16,0Hz); 6,10 (1H, d, 16,0 Hz) là tín hiệu của hai proton thuộc liên kết olefin không đóng vòng, vì hằng số tương tác lớn chứng tỏ liên kết C=C có cấu hình trans. Phổ 13C-NMR (DMSO, δC ppm, 125MHz) chothấy hợp chất HD01 có 30 carbon, trong đó: 10 Carbon bậc bốn ở δC 156,4, 133,1, 177,4, 161,1, 156,4, 103,8, 120,8, 159,9, 166,2, 124,9 ppm. 10 Carbon methine của vòng thơm ở δC ppm98,2; 93,7; 130,8(2C); 115,1(2C); 115,8(2C); 130,1(2C) ppm. Bốn cặp carbon có tín hiệu trùng nhau cho thấy sự có mặt của 2 vòng benzene thế para. 6 Carbon vòng đường glucopyranoside: tín hiệu đặc trưng cho carbon anomer δC 101,0 ppm; tín hiệu đặc trưng cho carbon oxymethylene δC 62,9 ppm; còn lại là các tín hiệu của 4 carbon CHOH δC 69,9; 74,1; 74,2 và 76,2 ppm. 2 Carbon olefin δC 145,1; 115,8 ppm và 2 carbon carbonyl δC 177,3; 166,1 ppm. Các tín hiệu carbon và proton trên phù hợp với đặc điểm của 1 khung flavone liên kết với 1 đơn vị glucoside và 1 đơn vị cinnamic acid. Từ các kết quả phân tích trên và so sánh với báo cáo của Phan Minh Giang et al. (2004) có thể kết luận hợp chất HD01 là tiliroside Tiliroside là hợp chất tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm, đã được thử nghiệm in vitro và in vivo cho kết quả tốt (Araceli Sala et al., 2003).

  1. KẾT LUẬN

Hai cao PE và DC chiết từ cây An Xoa được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư gan dòng HepG2 cho kết quả dương tính với giá trị IC50 lần lượt là 28,29 (g/mL) và 30,30 (g/mL). Từ cao PE cũng đã phân lập và nhận danh được 4 hợp chất: lupeol, stigmasterol, apigenin và tiliroside.

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *

.
.
.
.
0976 836 586